Когато се напръсква върху плевелите, продуктът се задържа върху листата. С помощта на съставените в него повърхностно‑активни вещества (сурфактанти) глифосатът прониква в листната тъкан, навлиза в ксилем‑флоемната система и се разпространява към растежните зони. Там се свързва с ключов ензим, необходим за синтеза на аминокиселини, което води до увяхване и смърт на растението. Тъй като активната съставка се абсорбира само през зелените части, гербицидът е ефективен само при растеж, който вече е над повърхността.
Практически всяко растение, което не е генетично модифицирано за резистентност към глифосат, е уязвимо. Най-рискови са растенията с големи листа – по-голямата повърхност осигурява по‑голямо поглъщане. Дървета и храсти с малки, восъчни листа са по‑устойчиви, но могат да бъдат унищожени от концентрирани формули. Дори пресечени стъбла и корени могат да задържат глифосат за месеци, което води до късни симптоми в следващия вегетационен период.
Според Агенцията за защита на околната среда (EPA) глифосатът е слабо токсичен за хора и животни. Въпреки това изследвания, публикувани в списание „Entropy“ (април 2013), показват, че глифосатът може да нарушава същите ензими в чревната микрофлора, както при растенията. Това поражда потенциална връзка с кожни заболявания, екзема, алергии, както и с по‑тежки състояния като Паркинсон, чернодробни заболявания и рак.